Melatonina vs rozuwastatyna w regeneracji kości – badanie porównawcze

Czy lokalne statyny i melatonina mogą zastąpić autograft w regeneracji kości?

Skuteczna implantacja wymaga wystarczających wymiarów wyrostka zębodołowego – zarówno dla stabilności implantu, jak i uzyskania zadowalających efektów estetycznych i funkcjonalnych. W sytuacjach niewystarczającej objętości kości klinicyści sięgają po różnorodne materiały augmentacyjne i membrany, jednak poszukiwanie optymalnych substancji stymulujących osteogenezę pozostaje aktualnym wyzwaniem. Szczególne zainteresowanie budzą preparaty o udokumentowanym działaniu osteoindukcyjnym, które można aplikować lokalnie – w tym statyny i melatonina.

Statyny, znane przede wszystkim jako inhibitory reduktazy HMG-CoA w terapii hipercholesterolemii, wykazują również właściwości wykraczające poza działanie hipolipemizujące. Hamują różnicowanie osteoklastów i stymulują produkcję czynników anabolicznych dla kości, w tym VEGF (vascular endothelial growth factor) i BMP-2 (bone morphogenetic protein 2), co prowadzi do wzmożonej osteoblastogenezy. Rozuwastatyna – syntetyczna statyna hydrofilna – wykazuje szczególnie korzystne właściwości farmakologiczne: selektywność wątrobową, minimalny metabolizm oraz silne hamowanie reduktazy HMG-CoA.

Melatonina (N-acetylo-5-metoksytryptamina), hormon wydzielany przez szyszynkę, szpik kostny, siatkówkę i jelita, pełni liczne funkcje fizjologiczne – od regulacji rytmu dobowego po aktywację układu odpornościowego. W kontekście metabolizmu kostnego melatonina działa dwutorowo: promuje różnicowanie osteoblastów poprzez aktywację szlaków sygnałowych BMP, ERK i Wnt, jednocześnie hamując różnicowanie osteoklastów przez zwiększenie ekspresji osteoprotegeryny – antagonisty RANKL. Badania in vivo potwierdziły, że miejscowa aplikacja melatoniny może stymulować osteogenezę wokół implantów tytanowych, wspierając proces osteointegracji.

Pomimo udokumentowanego pozytywnego wpływu obu substancji na wzrost kości, brakuje bezpośrednich badań porównawczych. Zespół z Isfahan University of Medical Sciences przeprowadził badanie eksperymentalne na szczurzym modelu defektów czaszki, porównując histopatologicznie efekt 5% żelu melatoniny i 1,2% żelu rozuwastatyny na formowanie nowej tkanki kostnej.

Jak zaprojektowano eksperyment na modelu szczurzym?

Do badania włączono 24 dorosłe samce szczurów szczepu Wistar o masie ciała 200 g, które losowo przydzielono do trzech grup po 8 zwierząt: grupa I – kontrolna (żel placebo), grupa II – melatonina (5% żel MEL), grupa III – rozuwastatyna (1,2% żel RSV). Badanie uzyskało zgodę komisji bioetycznej (IR.AJUMS.ABHC.REC.1401.007) i przeprowadzono je zgodnie z wytycznymi dotyczącymi postępowania ze zwierzętami laboratoryjnymi.

Żel melatoniny przygotowano przez powolne dodawanie metylocelulozy do gorącej wody destylowanej (80°C), a następnie rozpuszczenie odpowiedniej ilości melatoniny w pozostałej objętości wody. Żel rozuwastatyny powstał przez dodanie rozuwastatyny do żelu metylocelulozowego z konserwantami (parabeny sodowe) do uzyskania stężenia 1,2 mg/0,1 ml. Żel placebo zawierał wyłącznie metylocelulozę bez substancji aktywnej.

Procedurę chirurgiczną wykonywano w znieczuleniu ogólnym (ketamina 10 mg/kg + ksylazyna 10 mg/kg dootrzewnowo) z profilaktyką antybiotykową (enrofloksacyna 10 mg/kg podskórnie przez 3 dni). W kości czaszki każdego szczura wytworzono pojedynczy defekt krytyczny o średnicy 8 mm przy użyciu frezu trepanacyjnego pod obfitym chłodzeniem. Aby zapobiec uszkodzeniu opony twardej i tkanki mózgowej, kość stopniowo ścieniano, a następnie oddzielano od opony twardej za pomocą tępego narzędzia.

Defekty wypełniono 0,1 ml odpowiedniego preparatu zgodnie z przydziałem do grupy, a rany zamknięto pojedynczymi szwami prostymi (nylon 3-0). Po zabiegu zwierzę otrzymało podskórny zastrzyk sterylnej soli fizjologicznej w dawce 10 ml/kg/h operacji i pozostawało na czystym tlenie do odzyskania przytomności. Następnie szczury przeniesiono do pomieszczenia o stałej temperaturze 21°C i umieszczono w oddzielnych klatkach plastikowych z miękkim podłożem. W okresie pooperacyjnym zwierzęta miały nieograniczony dostęp do pokarmu i wody oraz otrzymywały morfinę w dawce 2,5 mg/kg dziennie przez 3 dni w celu kontroli bólu.

Po 28 dniach szczury uśmiercono przez podanie przedawkowania środków znieczulających dootrzewnowo (ksylazyna 10 mg/kg + ketamina 100 mg/kg). Następnie pobrano próbki zrekonstruowanej kości czaszki za pomocą piły chirurgicznej i poddano standardowej obróbce histologicznej: utrwalenie w 10% formalinie przez 5 dni w 20°C, demineralizacja w EDTA przez 2 dni, odwodnienie w 70% etanolu, zatopienie w parafinie i wybarwienie hematoksyliną-eozyną. Z każdego preparatu uzyskano 5-6 skrawków o grubości 5 μm.

Ocenę ilościową nowo uformowanej kości przeprowadzono za pomocą analizy kolorometrycznej w oprogramowaniu QuickPhoto Micro, a jakościową – przez doświadczonego patologa zaślepionego na przydział do grup. Odnotowano również typ nowo uformowanej kości (gąbczasta, blaszkowata lub mieszana).

Jakie efekty uzyskano w poszczególnych grupach?

Z analizy końcowej wyłączono 3 zwierzęta: jeden szczur z grupy RSV zmarł podczas zabiegu, a po jednym szczurze z grup MEL i kontrolnej wykluczono z powodu obecności nici chirurgicznej w miejscu defektu (czynnik zakłócający). Końcowa analiza objęła po 7 zwierząt w każdej grupie. Gojenie tkanek przebiegało bez powikłań u pozostałych szczurów.

Ocena mikroskopowa po 28 dniach ujawniła istotne różnice w charakterze gojenia między grupami. W grupie kontrolnej miejsce defektu wypełniała głównie tkanka zrębu kostnego (kallus) złożona z włókien tkanki łącznej, nowo uformowanych naczyń krwionośnych oraz licznych komórek zapalnych (makrofagi, limfocyty, neutrofile). Obserwowano krwotoki wynikające z przepuszczalności ścian młodych naczyń. Osteogeneza rozpoczynała się na brzegach defektu, a nowo uformowana kość gąbczasta rozrastała się w kierunku centrum – jednak w ograniczonym zakresie.

W grupie melatoniny stwierdzono liczne masy nowo uformowanej kości gąbczastej w miejscu defektu. Blaszki kostne charakteryzowały się nieregularnym ułożeniem i różnymi kierunkami przebiegu. W jamkach kostnych obecne były osteocyty, a wokół nich – aktywne osteoblasty. Między masami kości gąbczastej widoczne były duże naczynia zawierające erytrocyty i liczne leukocyty, co świadczy o aktywnym procesie angiogenezy towarzyszącym osteogenezie.

Podobny obraz histologiczny obserwowano w grupie rozuwastatyny – liczne ogniska nowo uformowanej kości gąbczastej w tkance zrębu łącznego, z porównywalną ilością nowej tkanki kostnej jak w grupie melatoniny.

Analiza ilościowa wykazała, że średni procent powierzchni defektu zajętej przez nową tkankę kostną wynosił: 22,41% ± 4,35 w grupie MEL, 23,16% ± 7,16 w grupie RSV i 8,41% ± 3,73 w grupie kontrolnej. Test ANOVA potwierdził istotne statystycznie różnice między grupami (p<0,05). Analiza post-hoc testem Tukeya ujawniła, że zarówno melatonina, jak i rozuwastatyna istotnie przewyższały grupę kontrolną (p<0,05), natomiast nie stwierdzono istotnej różnicy między grupą MEL a RSV (p>0,05).

Jak melatonina i rozuwastatyna stymulują osteogenezę?

Mechanizmy działania obu substancji, choć różne na poziomie molekularnym, prowadzą do podobnego efektu końcowego – wzmożonej osteogenezy. Rozuwastatyna, jak inne statyny, hamuje reduktazę HMG-CoA, ograniczając szlak mewalonianowy. To z kolei prowadzi do zwiększenia ekspresji genu BMP-2 i stymulacji różnicowania osteoblastów we wczesnych i średnich fazach kultury komórkowej. Jako statyna hydrofilna, rozuwastatyna wykazuje większą selektywność wątrobową i skuteczność w procesach mineralizacji niż statyny lipofilne.

Wcześniejsze badania potwierdzają osteogenne właściwości rozuwastatyny. Türer i wsp. wykazali, że lokalna aplikacja 1 mg RSV wraz z autogennym przeszczepem kostnym wzmacnia regenerację kości w defektach krytycznych czaszki szczurów. W innym badaniu tej samej grupy stwierdzono, że RSV przyspiesza wczesną regenerację kostną w złamaniach żuchwy szczurów – efekt był szczególnie widoczny po 2 tygodniach, choć po 28 dniach różnice między grupami się zacierały. Özer i wsp. zaobserwowali istotnie większe formowanie nowej kości po 12 tygodniach przy zastosowaniu RSV z ksenograftem u królików.

Melatonina działa przez bezpośrednią stymulację osteoblastów, przyspieszając różnicowanie preosteoblastów i następczą produkcję macierzy kostnej oraz jej kalcyfikację. Aktywuje szlaki sygnałowe BMP/ERK/Wnt, jednocześnie hamując różnicowanie osteoklastów poprzez zwiększenie ekspresji osteoprotegeryny – naturalnego antagonisty RANKL. Dodatkowo melatonina wykazuje działanie proangiogenne, co potwierdził Calvo-Guirado i wsp., obserwując znaczną indukcję angiogenezy w pierwszych 4 tygodniach oraz utrzymanie homeostazy naczyń włosowatych. Penetracja naczyń krwionośnych umożliwia migrację komórek osteogennych i angiogennych do miejsca defektu.

Shino i wsp. wykazali, że lokalna aplikacja melatoniny zwiększa regenerację kości w czaszce szczurów, a Cutando i wsp. stwierdzili poprawę formowania kości okołowszczepowej i osteointegracji implantów dentystycznych u psów rasy beagle. Metaanaliza Lopez-Valverde i wsp. potwierdziła, że u zwierząt kontakt kość-implant tytanowych implantów dentystycznych zwiększa się 2-6 tygodni po umieszczeniu przy jednoczesnym zastosowaniu melatoniny.

„Nasze wyniki ujawniły, że osteogeneza była istotnie wyższa w grupach MEL i RSV niż w grupie kontrolnej, a żele MEL i RSV mogą być stosowane jako stymulatory formowania kości” – piszą autorzy badania.

Jakie znaczenie mają te wyniki dla praktyki stomatologicznej?

Wyniki badania mają potencjalne znaczenie dla chirurgii stomatologicznej i implantologii, szczególnie w kontekście augmentacji wyrostka zębodołowego przed implantacją. Tradycyjnie stosowane autografty, choć uważane za złoty standard, wiążą się z ograniczeniami: koniecznością pobrania materiału z miejsca dawczego, ryzykiem powikłań w tym miejscu oraz ograniczoną dostępnością. Materiały alloplastyczne, choć eliminują te problemy, często nie wykazują wystarczających właściwości osteoindukcyjnych.

Lokalna aplikacja melatoniny i rozuwastatyny może stanowić uzupełnienie lub alternatywę dla tradycyjnych metod augmentacji. Szczególnie obiecujące jest to, że oba preparaty można łatwo aplikować w formie żelu, co jest praktyczne z punktu widzenia klinicznego. Dodatkowo, w badaniu Koç i wsp. wykazano synergistyczny efekt kombinacji simwastatyny i melatoniny na regenerację kości – simwastatyna skracała czas regeneracji bardziej niż melatonina, a ich łączne zastosowanie potęgowało efekt, szczególnie w końcowej fazie naprawy.

Badanie Pankaj i wsp. dotyczące leczenia przewlekłego zapalenia przyzębia potwierdziło kliniczną użyteczność 1,2% żelu RSV – po 6 i 12 miesiącach obserwowano zmniejszenie głębokości kieszonek przyzębnych, wzrost poziomu przyczepu klinicznego i wypełnienie ubytków kostnych. Co więcej, poprawa wskaźników w grupie stosującej RSV była istotnie większa niż w grupie stosującej metforminę.

Autorzy obecnego badania podkreślają jednak kilka ważnych ograniczeń wymagających dalszych badań. Po pierwsze, oceniono tylko jeden punkt czasowy (28 dni) – nie wiadomo, jak długo utrzymuje się efekt i czy różnice między preparatami ujawniłyby się przy dłuższej obserwacji. Po drugie, testowano tylko jedną dawkę każdego preparatu – optymalne stężenia mogą być inne. Po trzecie, badanie przeprowadzono na zwierzętach – konieczne są badania kliniczne z udziałem ludzi, aby potwierdzić skuteczność i bezpieczeństwo tych preparatów w praktyce stomatologicznej.

Co wymaga dalszych badań przed wdrożeniem do praktyki?

Autorzy wskazują na kilka kierunków przyszłych badań niezbędnych do przełożenia tych wyników na praktykę kliniczną. Przede wszystkim konieczne są badania zależności dawka-odpowiedź – zarówno dla melatoniny, jak i rozuwastatyny – aby określić optymalne stężenia maksymalizujące osteogenezę przy minimalnym ryzyku działań niepożądanych. Obecne badanie testowało tylko jedno stężenie każdego preparatu (5% MEL, 1,2% RSV), oparte na doniesieniach z literatury, ale systematyczna ocena różnych dawek mogłaby ujawnić bardziej skuteczne protokoły.

Równie istotne są badania długoterminowe z wieloma punktami czasowymi oceny. Badanie Türer i wsp. sugeruje, że efekt rozuwastatyny może być szczególnie wyraźny we wczesnych fazach gojenia (2 tygodnie), a następnie zmniejszać się – warto więc ocenić dynamikę działania obu preparatów w czasie (np. 1, 2, 4, 8, 12 tygodni) oraz porównać je z naturalnym procesem gojenia.

Kolejnym kierunkiem są badania nad różnymi formulacjami i nośnikami. Obecne badanie wykorzystało żel metylcelulozowy, ale inne formy (np. gąbki kolagenowe, materiały ceramiczne, hydrożele) mogą zapewnić lepszą kontrolę uwalniania substancji aktywnej i dłuższe utrzymanie stężeń terapeutycznych w miejscu defektu. Warto również zbadać efekty synergistyczne – kombinacja melatoniny i rozuwastatyny lub ich połączenie z materiałami osteokonduktywnymi (np. hydroksyapatytem, β-TCP) może potęgować efekt osteogenny.

Z metodologicznego punktu widzenia autorzy sugerują przeprowadzenie badań na większych zwierzętach z utworzeniem kilku defektów w jednej czaszce, co pozwoliłoby na bezpośrednie porównanie różnych interwencji u tego samego osobnika, eliminując wpływ zmienności międzyosobniczej. Ostatecznie, randomizowane badania kliniczne u ludzi są niezbędne do oceny skuteczności, bezpieczeństwa i praktycznej użyteczności tych preparatów w chirurgii stomatologicznej i implantologii.

Czy warto rozważyć te preparaty w codziennej praktyce?

Wyniki tego badania eksperymentalnego dostarczają przekonujących dowodów na osteogenne właściwości lokalnie aplikowanej melatoniny i rozuwastatyny w modelu zwierzęcym. Prawie trzykrotne zwiększenie formowania nowej kości w porównaniu z placebo (22-23% vs 8% powierzchni defektu po 28 dniach) sugeruje potencjał kliniczny tych preparatów jako stymulatorów regeneracji kostnej. Porównywalna skuteczność obu substancji jest szczególnie interesująca – lekarze mogliby wybierać preparat w zależności od dostępności, kosztów lub profilu bezpieczeństwa pacjenta. Melatonina jako naturalny hormon może być lepiej tolerowana i wiązać się z mniejszym ryzykiem interakcji lekowych, podczas gdy rozuwastatyna jako lek o ugruntowanej pozycji w farmakoterapii może być łatwiej dostępna i tańsza w produkcji. Niemniej jednak, przed wprowadzeniem tych preparatów do rutynowej praktyki klinicznej konieczne są dalsze badania – w tym optymalizacja dawkowania, ocena długoterminowych efektów, testowanie różnych formulacji oraz przede wszystkim weryfikacja skuteczności i bezpieczeństwa w badaniach klinicznych z udziałem ludzi.