Nowe media hodowlane rewolucjonizują terapię CAR-T

Czy nowe media hodowlane rewolucjonizują terapię CAR-T?

Terapia komórkowa CAR-T stanowi przełom w immunoterapii nowotworów, umożliwiając genetyczną modyfikację limfocytów T pacjenta do rozpoznawania i eliminowania komórek nowotworowych. Mimo wysokiej skuteczności w leczeniu opornych postaci białaczek i chłoniaków, proces produkcji komórek CAR-T napotyka na wyzwania związane z heterogenicznością populacji komórkowych, zmiennym stopniem aktywacji i różnicowania, co może wpływać na ich efektywność i przetrwanie in vivo. Kluczowym czynnikiem determinującym jakość terapeutycznych limfocytów T pozostaje dobór odpowiedniego medium hodowlanego.

Naukowcy zidentyfikowali media bez dodatku surowicy jako istotny element optymalizacji procedur wytwarzania komórek CAR-T, przyspieszający ich dostępność dla pacjentów i eliminujący problemy związane z mediami zawierającymi surowicę. W badaniach porównawczych wykazano, że różne media hodowlane mogą selektywnie promować określone fenotypy limfocytów T – przykładowo medium TexMACS sprzyja proliferacji komórek efektorowych, podczas gdy AIM-V wspiera ekspansję komórek pamięci centralnej. Dodatkowo zaobserwowano, że media przypominające ludzkie osocze mogą skuteczniej aktywować limfocyty T niż standardowe RPMI.

Czy wyspecjalizowane dodatki poprawiają efektywność transdukcji?

W najnowszych badaniach naukowcy skoncentrowali się na opracowaniu protokołu zwiększającego efektywność transdukcji wirusowej podczas produkcji komórek CAR-T, wykorzystując medium Nutri-T bez dodatku surowicy wzbogacone o rosuwastatynę (lek z grupy statyn) oraz BX795 (inhibitor kompleksu TBK1/IKKɛ). Rosuwastatyna, powszechnie stosowana w leczeniu hipercholesterolemii, zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej w komórkach NK poprzez regulację ekspresji receptorów lipoprotein o niskiej gęstości (LDLR), co ułatwia wnikanie wirusa i efektywniejszą modyfikację genetyczną. Dodatkowo wykazuje działanie przeciwzapalne, potencjalnie tworząc korzystniejsze mikrośrodowisko dla terapii adoptywnych, oraz łagodzi aktywację i wyczerpanie limfocytów T poprzez regulację ekspresji markerów takich jak PD-1 i Tim3.

BX795, farmakologiczny inhibitor kompleksu TBK1/IKKɛ, wykazał zdolność do zwiększania efektywności transdukcji lentiwirusowej zarówno w komórkach NK, jak i limfocytach T. Jako inhibitor TBK1/IKKɛ, BX795 przezwycięża naturalną odporność komórek NK na transdukcję wirusową poprzez tymczasowe zahamowanie mechanizmów przeciwwirusowych, umożliwiając wydajniejszą modyfikację genetyczną bez naruszania żywotności, funkcji czy proliferacji komórek. Ponadto, zastosowanie BX795 zwiększa odsetek limfocytów T CD8+ w populacjach poddanych transdukcji, co może wzmacniać odpowiedź cytotoksyczną i sprzyjać trwałej odpowiedzi przeciwnowotworowej.

Jak media hodowlane wpływają na aktywację i pamięć limfocytów T?

W przeprowadzonych eksperymentach porównano proliferację nietransformowanych limfocytów T w różnych warunkach hodowlanych: komórki aktywowane OKT3 (100 ng/mL) hodowane w medium Nutri-T (NO), komórki aktywowane OKT3 hodowane w RPMI 1640 + 10% surowicy ludzkiej (HO), oraz te same warunki wzbogacone o IL-2 (200 U) – odpowiednio NOI i HOI. Po izolacji PBMC komórki hodowano w wymienionych mediach i liczono w 7. dniu, aby ocenić proliferację. Zaobserwowano, że NOI znacząco zwiększyło proliferację komórek w porównaniu z HOI, w tym frakcji komórek CD3+ i CD8+. Dodatkowo, analizując ekspresję markerów CD45RO i CCR7 w komórkach CD3+ i CD8+, stwierdzono zwiększony odsetek fenotypu pamięci centralnej (CD45RO+CCR7+) w komórkach hodowanych w medium NOI.

Dane z cytometrii przepływowej wskazały również, że aktywacja limfocytów T prowadzi do zwiększenia objętości komórek w 1. dniu, przy czym największą objętość zaobserwowano w NOI. Mimo że objętość komórek zmniejszyła się do 7. dnia, NOI nadal wykazywało największą objętość. Wyniki te potwierdzają, że NOI znacząco zwiększa proliferację komórek i funkcjonalną pamięć nietransformowanych limfocytów T w porównaniu z HOI.

Naukowcy zbadali również wpływ mediów na aktywację i wyczerpanie limfocytów T, analizując ekspresję markerów CD69/CD107a (aktywacja) oraz TIM3/LAG3 (wyczerpanie) metodą cytometrii przepływowej. Odsetek komórek CD3+ w 3. dniu znacząco wzrósł w hodowlach prowadzonych w medium Nutri-T w porównaniu z RPMI 1640, podobnie jak ekspresja markerów aktywacji CD69 i CD107a w 1. dniu. Z kolei markery wyczerpania LAG3 i TIM3 obserwowane w 7. dniu w komórkach CD3+ były znacząco wyższe w HOI w porównaniu z NOI. Analogiczne wyniki uzyskano dla populacji komórek CD8+, potwierdzając, że NOI znacząco zwiększa odsetek komórek CD3+ i CD8+, wzmacnia ekspresję markerów aktywacji i obniża ekspresję markerów wyczerpania w porównaniu z HOI.

Czy nowe kombinacje czynników zwiększają transdukcję wirusową?

Po ustaleniu, że limfocyty T wykazują lepszą odpowiedź w medium Nutri-T, zbadano wpływ tego medium na efektywność transdukcji. W tym celu przeprowadzono miareczkowanie lentiwirusa kodującego EGFP i obliczono jednostki transdukcji (TU), reprezentujące liczbę funkcjonalnych cząstek wirusowych zdolnych do transdukcji komórki i ekspresji transgenu. Wykazano, że zwiększanie rozcieńczenia jest wprost proporcjonalne do jednostek transdukcji/mL, co oznacza, że wyższa liczba cząstek jest wymagana do skutecznej transdukcji. Wyizolowane PBMC aktywowano OKT3, poddano transdukcji wirusami CAR-HER2-EGFP i hodowano w odpowiednich mediach. Zaobserwowano, że odsetek transdukcji i MFI (średnia intensywność fluorescencji) znacząco wzrosły, gdy komórki CAR-HER2-EGFP hodowano w NOI w porównaniu z HOI.

Następnie zbadano wpływ BX795 (6 nM) i rosuwastatyny (5 nM) na efektywność transdukcji limfocytów T, stosując następujące kombinacje w medium Nutri-T: NOI z dodatkiem BX795 (NOIB), NOI z dodatkiem rosuwastatyny (NOIR) oraz NOI z dodatkiem obu substancji (NOIBR). Hodowla w medium NOI skutkowała średnim odsetkiem transdukcji na poziomie 51,7%; po dodaniu BX795 (NOIB) odsetek ten znacząco wzrósł do średnio 77,7%. Również rosuwastatyna (NOIR) istotnie zwiększyła średni odsetek transdukcji do 58,1% (w porównaniu z NOI). Po jednoczesnym dodaniu BX795 i rosuwastatyny średni odsetek transdukcji wzrósł w NOIBR do 82,7%, co stanowiło istotną poprawę w porównaniu zarówno z NOIB, jak i NOIR. Podobne, lecz bardziej wyraźne wyniki zaobserwowano analizując dane geomean transdukcji EGFP; MFI NOIBR była znacząco wyższa niż NOIB lub NOIR. Co ważne, zastosowane stężenia BX795 i rosuwastatyny były znacznie niższe (5-6 nM) niż opisywane wcześniej w literaturze (2-10 μM dla BX795 i 0,5-20 μM dla rosuwastatyny), co minimalizuje potencjalną toksyczność dla limfocytów T.

Czy CAR-T działają lepiej po modyfikacji protokołu?

Aby ocenić funkcjonalność skonstruowanych komórek CAR-HER2-EGFP w medium NOIBR, przeprowadzono test degranulacji w 7. dniu, mierząc ekspresję powierzchniowego markera CD107a na komórkach CAR-HER2-EGFP po inkubacji z komórkami docelowymi JIMT1, CAL33, A375 i A549. Zaobserwowano, że degranulacja komórek CAR-HER2-EGFP była istotnie wyższa, gdy komórki hodowano w NOIBR i inkubowano z liniami komórek docelowych w porównaniu z HOIBR, wskazując na wyższą funkcjonalność skonstruowanych komórek CAR-T w medium NOIBR. Następnie przeprowadzono test cytotoksyczności wobec linii komórkowych JIMT1, CAL33, A375 i A549, wykazując, że limfocyty T hodowane w NOIBR były znacząco bardziej efektywne niż hodowane w HOIBR, szczególnie przy stosunku efektorów do komórek docelowych wynoszącym 2:1. Dodatkowo, analiza sekrecji IFNγ po 24 godzinach wykazała wyższe wydzielanie tego cytokinu przez komórki hodowane w NOIBR niż w HOIBR, potwierdzając wyższą funkcjonalność komórek CAR-T wytworzonych w NOIBR.

Jakie mechanizmy napędzają ekspansję limfocytów T?

Mechanizm działania opracowanego protokołu opiera się na synergistycznym działaniu kilku czynników: OKT3 wiąże się z CD3 i aktywuje limfocyty T, Nutri-T wzmacnia aktywację i funkcjonalną pamięć limfocytów T, BX795 działa jako inhibitor TBK1, zapobiegając odpowiedzi przeciwwirusowej, a rosuwastatyna zwiększa ekspresję receptora LDL, dodatkowo wzmacniając efektywność transdukcji wirusowej i finalnie ekspresję funkcjonalnych komórek CAR-T.

Opracowana metodologia wspiera ekspansję limfocytów T w krótszym czasie (5-7 dni), co pozwala zachować wyższy odsetek komórek pamięci centralnej. Krótsze okresy hodowli wykazały zwiększoną skuteczność przeciwnowotworową w badaniach przedklinicznych – komórki CAR-T zebrane po 3-5 dniach wykazywały lepszą kontrolę guza w porównaniu z hodowanymi przez 9 dni w modelach ksenoprzeszczepów u myszy. Ponadto, krótsze okresy hodowli mogą poprawić przetrwanie, żywotność i zdolność do samoodnawiania limfocytów T po reinfuzji, sprzyjając lepszym długoterminowym wynikom u pacjentów. Ograniczenie czasu hodowli pomaga zachować funkcję efektorową limfocytów T in vivo. Obecne wytyczne FDA nakazują dodatkowe testy dla okresów hodowli przekraczających 96 godzin po transdukcji; przyjęcie okresu hodowli krótszego niż 5 dni może ominąć ten kosztowny wymóg. Przedłużona hodowla ex vivo może prowadzić do wyczerpania limfocytów T, potencjalnie zmniejszając skuteczność terapeutyczną po podaniu pacjentowi. Dodatkowo, ekspresja CD107a, która jest kluczowa dla pomiaru degranulacji, jest najbardziej wyraźna wkrótce po aktywacji.

Jak optymalizować stymulację limfocytów T w procesie CAR-T?

Konwencjonalna metoda wykorzystuje kulki CD3/CD28, jednak badania wykazały, że sama stymulacja OKT3 jest również skuteczna. OKT3 lepiej zachowuje mniej zróżnicowany fenotyp limfocytów T, przy czym limfocyty T namnażane za pomocą OKT3/IL-2 wykazują silniejszy profil pamięci efektorowej, co jest korzystne dla eliminacji nowotworów. Dodatkowo, rozpuszczalny OKT3 powoduje mniej zgonów komórek indukowanych antygenem w komórkach CD8 i pozwala na bardziej precyzyjną kontrolę siły stymulacji, w przeciwieństwie do Dynabeads, które zapewniają stałą stymulację i mogą wymagać dodatkowych etapów oczyszczania ze względu na zanieczyszczenie kulkami. Chociaż Dynabeads są skuteczne, szczególnie dla komórek CD4+, OKT3 oferuje korzyści, zwłaszcza dla komórek CD8+.

Badania wykazały, że sam IL-2 pozwala na bardziej ukierunkowaną stymulację subpopulacji limfocytów T, podczas gdy dodanie cytokin takich jak IL-7 lub IL-15 może komplikować odpowiedzi poprzez aktywację niepożądanych populacji limfocytów. Skupienie się na pojedynczej cytokinie upraszcza optymalizację i zwiększa powtarzalność procesu. Nawet przy umiarkowanych stężeniach (50-200 IU/mL) IL-2 może osiągnąć znaczącą ekspansję limfocytów T bez potrzeby stosowania dodatkowych cytokin.

Jak monitorować wczesne etapy aktywacji limfocytów T?

Aktywacja limfocytów T jest dynamicznym procesem, który rozpoczyna się szybko po stymulacji. Wczesne markery aktywacji, takie jak CD69, ulegają zwiększonej ekspresji w ciągu kilku godzin, podczas gdy ekspresja CD25 wzrasta w ciągu 24 godzin od aktywacji. Ocena tych markerów aktywacji w pierwszych dniach może pomóc uchwycić szczytową ekspresję wczesnych i pośrednich markerów, oferując jasny obraz początkowej odpowiedzi limfocytów T. W przeciwieństwie do tego, wyczerpanie limfocytów T rozwija się stopniowo wraz z przedłużoną ekspozycją na antygen. Receptory hamujące, takie jak PD-1, LAG-3 i TIM-3, wykazują zwiększoną ekspresję po kilku dniach stymulacji, a wyczerpane limfocyty T zazwyczaj wykazują zmniejszone funkcje efektorowe i produkcję cytokin do 7. dnia w porównaniu z aktywowanymi limfocytami T. Ta strategia czasowa pomaga odróżnić prawdziwie aktywowane limfocyty T od tych przechodzących w stan wyczerpania, zapewniając kompleksowy obraz funkcjonalności limfocytów T w czasie.

Warto podkreślić, że stężenia rosuwastatyny i BX795 stosowane w badaniu były znacznie niższe niż opisywane w literaturze, co minimalizuje potencjalną toksyczność dla limfocytów T. W limfocytach T, leczenie 4 μM BX795 wykazało zachowanie wzrostu i funkcji komórek, podczas gdy niektóre badania sugerują, że 6 μM BX795 utrzymuje niską toksyczność przy jednoczesnym osiągnięciu optymalnej wydajności transdukcji zarówno w komórkach NK, jak i limfocytach T. Co ważne, hamujący wpływ BX795 na odpowiedzi przeciwwirusowe jest odwracalny, umożliwiając jego stosowanie podczas procesu transdukcji bez trwałej zmiany wrodzonych mechanizmów przeciwwirusowych komórek. Optymalne stężenie rosuwastatyny dla zwiększenia transdukcji lentiwirusowej wynosi 5 μM, ponieważ maksymalnie zwiększa ekspresję LDLR w komórkach NK bez wpływu na żywotność komórek. Przy tym stężeniu rosuwastatyna zwiększa ekspresję białka LDLR co najmniej trzykrotnie w komórkach immunologicznych. Wykazano, że rosuwastatyna wykazuje działanie wzmacniające odporność w niektórych warunkach, w tym zwiększenie odsetka komórek NKT i zmniejszenie liczby komórek NK TIM-3+ u pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby typu B.

Czy opracowany protokół przynosi realne korzyści?

Podsumowując, opracowany protokół wykorzystujący medium Nutri-T bez dodatku surowicy, wzbogacone o niskie stężenia rosuwastatyny i BX795, znacząco zwiększa efektywność transdukcji wirusowej podczas produkcji komórek CAR-T, przy jednoczesnym zachowaniu ich funkcjonalności. Metodologia ta może być wykorzystana do generowania stabilnych i wydajnych komórek CAR-T do immunoterapii, potencjalnie poprawiając wyniki leczenia pacjentów onkologicznych.

Podsumowanie

Opracowany protokół wykorzystujący medium Nutri-T bez dodatku surowicy, wraz z dodatkiem rosuwastatyny i BX795 w niskich stężeniach, stanowi znaczący postęp w produkcji komórek CAR-T. Badania wykazały, że zastosowanie tego medium znacząco zwiększa proliferację komórek, szczególnie frakcji CD3+ i CD8+, oraz wspiera rozwój komórek pamięci centralnej. Dodatek rosuwastatyny i BX795 synergistycznie zwiększa efektywność transdukcji wirusowej do poziomu 82,7%, co stanowi istotną poprawę w porównaniu z konwencjonalnymi metodami. Skrócenie czasu hodowli do 5-7 dni pozwala zachować wyższy odsetek komórek pamięci centralnej i poprawia ich funkcjonalność. Komórki CAR-T wyprodukowane według nowego protokołu wykazują lepszą aktywność cytotoksyczną i wyższe wydzielanie IFNγ, co przekłada się na ich większą skuteczność w eliminacji komórek nowotworowych. Metodologia ta może znacząco poprawić efektywność terapii CAR-T w leczeniu pacjentów onkologicznych.