Nowe metody ekstrakcji w diagnostyce farmakokinetycznej – przełom w badaniach

Czy nowe metody ekstrakcji zmieniają diagnostykę farmakokinetyczną?

Badanie porównawcze przeprowadzone przez zespół badawczy stanowi kompleksową analizę metodologiczną dotyczącą nowej techniki ekstrakcji wspieranej cieczą (SLE – Supported Liquid Extraction) w porównaniu do tradycyjnej ekstrakcji ciecz-ciecz (LLE – Liquid-Liquid Extraction) w kontekście oznaczania stężenia rosuwastatyny w osoczu pacjentów po zawale mięśnia sercowego.

Choroba sercowo-naczyniowa na podłożu miażdżycowym (ASCVD) odpowiada za około 45% przedwczesnych zgonów, z czego około 11% przypisuje się ostremu zawałowi mięśnia sercowego. Główne czynniki ryzyka ASCVD obejmują cząsteczki lipoprotein zawierające apolipoproteinę B (ApoB), w tym przede wszystkim lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL), a także nadciśnienie tętnicze, palenie tytoniu, otyłość i cukrzycę.

Rosuwastatyna jest syntetycznym lekiem obniżającym poziom lipidów, który może być przepisywany w różnych dawkach od 5 do 40 mg dziennie. Biodostępność doustna rosuwastatyny po pojedynczej dawce wynosi 20%, podczas gdy wchłanianie sięga około 50%. Farmakokinetyka rosuwastatyny zależy nie tylko od dawki, ale również od polimorfizmów genetycznych, szczególnie w białkach transportowych ABCG2 i SLCO1B1, rasy, jednoczesnego stosowania innych leków oraz obecności chorób współistniejących. W rezultacie stężenie może znacznie się różnić między pacjentami, wpływając na skuteczność i toksyczność leku. Ponieważ rosuwastatyna jest wydalana w dużej mierze w postaci niezmienionej, z około 90% niepodlegających metabolizmowi, badanie skupiło się wyłącznie na ilościowym oznaczaniu niezmetabolizowanej cząsteczki.

Jakie są różnice między SLE a tradycyjnymi metodami ekstrakcji?

Dotychczas ustanowiono kilka zwalidowanych metod ilościowego oznaczania stężenia rosuwastatyny w osoczu. Większość z tych metod wykorzystuje ekstrakcję ciecz-ciecz (LLE), która pozwala na uzyskanie dolnej granicy oznaczalności (LLOQ) na poziomie nawet 0,02 ng/ml, podczas gdy inne stosują ekstrakcję do fazy stałej (SPE). Jednakże, według najlepszej wiedzy autorów, żadna z nich nie wykorzystywała ekstrakcji wspieranej cieczą (SLE) do przygotowania próbek.

LLE jest szeroko stosowaną techniką ekstrakcji, która rozdziela związki na podstawie różnic w ich rozpuszczalności między dwiema niemieszającymi się fazami ciekłymi, zwykle fazą wodną i rozpuszczalnikiem organicznym. Po wymieszaniu, rozdzielenie faz jest ułatwione przez wirowanie, a anality preferencyjnie przechodzą do warstwy organicznej. Podobnie, SLE wykorzystuje różnice w rozpuszczalności, ale używa porowatego stałego nośnika, takiego jak ziemia okrzemkowa, do adsorpcji próbek wodnych. Po nałożeniu rozpuszczalnika organicznego, anality efektywnie rozdzielają się do fazy organicznej, umożliwiając skuteczne oddzielenie od bardziej polarnych składników matrycy, które pozostają zaadsorbowane.

Jakie cele naukowe stawiano w badaniu?

Oczekuje się, że metoda SLE będzie miała lepszy odzysk i powtarzalność w porównaniu do LLE. Dodatkowo, proces SLE jest znacznie łatwiejszy do automatyzacji. W przeciwieństwie do LLE, nie ma potrzeby intensywnego wstrząsania ani ostrożnego pipetowania w celu rozdzielenia warstw. Ponadto, ponieważ metoda SLE opiera się na kartridżach, umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek, co może znacznie zwiększyć przepustowość, a jednocześnie zmniejszyć zużycie rozpuszczalników organicznych. W porównaniu do SPE, SLE jest szybszą i bardziej opłacalną metodą, ponieważ nie wymaga przygotowania kartridża i etapów płukania.

Głównym celem badania było opracowanie szybkiej, dokładnej i precyzyjnej metody ilościowego oznaczania rosuwastatyny w próbkach osocza pacjentów przyjmujących wysokie dawki tego leku. W celu oceny wykonalności i wydajności porównano dwie metody przygotowania próbek: nowatorską metodę SLE i klasyczną metodę LLE jako referencję. Badacze dążyli również do walidacji metody SLE z detekcją LC-MS/MS do ilościowego oznaczania stężenia rosuwastatyny w osoczu pacjentów otrzymujących terapię wysokimi dawkami (20 lub 40 mg/dzień) po zawale mięśnia sercowego, aby ocenić jej zdolność do monitorowania przestrzegania terapii przez pacjentów i oceny odpowiedzi pacjentów na leczenie rosuwastatyną, ponieważ zawał mięśnia sercowego może wpływać na profil farmakokinetyczny leku.

Jak przebiega analiza rosuwastatyny przy użyciu LC-MS/MS?

W badaniu zastosowano chromatografię cieczową sprzężoną z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) do analizy rosuwastatyny w próbkach osocza. Jako wewnętrzny standard zastosowano rosuwastatynę znakowaną deuterem (D6). Przygotowanie próbek obejmowało dwie metody ekstrakcji: SLE i LLE. W metodzie SLE próbka osocza została załadowana na stały nośnik, a następnie wymyta za pomocą tert-butylowego eteru metylowego (TBME) z dodatkiem 10% izopropanolu. W metodzie LLE zastosowano ekstrakcję ciecz-ciecz z użyciem tych samych rozpuszczalników organicznych.

Analiza chromatograficzna była przeprowadzana przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej Agilent 1290 Infinity II (UHPLC) sprzężonej z detektorem mas potrójnego kwadrupola/pułapki jonowej liniowej, Sciex QTRAP 5500+. Faza ruchoma składała się z rozpuszczalnika A: 0,025% kwasu octowego w wodzie Milli-Q i rozpuszczalnika B: 99,9% acetonitrylu, dostarczanych z prędkością 0,5 ml/min. Stosowano kolumnę Agilent Poroshell 120 EC-C18 (50 x 2,1 mm z cząstkami 1,9 µm) utrzymywaną w temperaturze 40°C. Całkowity czas analizy wynosił 4 minuty, z objętością nastrzyku 0,5 μl.

Jak oceniono efektywność nowych metod ekstrakcji?

Walidacja metody SLE wykazała doskonałą selektywność, akceptowalny efekt matrycy, wysoką wydajność ekstrakcji (96% dla niskiego stężenia i 83% dla wysokiego stężenia) oraz dobrą liniowość w zakresie 0,1-50 ng/ml. Dokładność i precyzja metody SLE spełniały kryteria akceptacji na wszystkich poziomach stężeń. Metoda SLE pozwoliła na osiągnięcie niższej granicy oznaczalności (LLOQ) na poziomie 0,1 ng/ml, podczas gdy dla metody LLE LLOQ wynosił 0,3 ng/ml ze względu na niską dokładność (73,5%) i precyzję (RSD 73%) przy niższych stężeniach.

Metoda SLE wykazała wyższe odpowiedzi w próbkach kontroli jakości, szczególnie przy niższych stężeniach (109,3% vs 92,8%), co może wynikać z wyższego odzysku ekstrakcji na niższych poziomach (96,3% vs 60,0%) i niższych efektów matrycowych (12,7% vs -36,7%). Ponadto, zaobserwowano lepszą precyzję dla wszystkich stężeń, szczególnie przy 15 ng/ml (3,2% vs 7,3%).

Koszty analizy na próbkę są wyższe w przypadku SLE, ponieważ oprócz odczynników wymagane są również kartridże. W około 50% próbek analizowanych metodą LLE zaobserwowano osad, podczas gdy przy SLE nie był on widoczny. W konsekwencji, komponenty HPLC mogą być bardziej niekorzystnie narażone przy LLE, zwiększając koszty analizy wynikające z krótszej żywotności materiałów eksploatacyjnych chromatograficznych i nieprzewidywalnych problemów sprzętowych. Ponadto, LLE jest bardziej wymagająca dla analityków, zajmuje więcej czasu i stanowi większe wyzwanie dla automatyzacji.

Porównanie obu metod na 30 próbkach osocza pacjentów wykazało, że metoda LLE systematycznie dawała niższe wyniki stężenia rosuwastatyny (mediana 7,4 ng/ml, zakres 2,4-37,9 ng/ml) w porównaniu do metody SLE (mediana 9,1 ng/ml, zakres 2,18-35,1 ng/ml). Analiza Bland-Altmana wykazała średnią różnicę między metodami na poziomie 14,64% z 95% przedziałem ufności 12,08-17,21%. Regresja Passing-Bablok wskazała na liniową zależność między metodami (SLE = 0,1192 + 1,144*LLE) z przedziałem ufności 95% dla przecięcia -0,1942 do 0,6199 i nachyleniem 95% CI od 1,079 do 1,189.

Różnice w wynikach mogą wynikać z różnic w wydajności ekstrakcji, efektach matrycowych, specyficzności i czułości metody. Zgodnie z ustaleniami innych badań porównujących te metody, nasze wyniki sugerują, że wyższy odzysk SLE jest prawdopodobnie kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do podwyższonych wyników w naszym przypadku. Biorąc pod uwagę szeroki zakres dawkowania rosuwastatyny (5-40 mg dziennie) i wysoką zmienność farmakokinetyczną, obserwowane odchylenie między obiema metodami prawdopodobnie nie doprowadzi do żadnych znaczących decyzji klinicznych, takich jak dostosowanie dawki czy zmiana leków. Jednak metoda o lepszym odzysku, wyższej czułości i niższych efektach matrycowych może oferować ważne korzyści dla dokładności danych farmakokinetycznych uzyskanych w określonych populacjach, gdzie małe różnice mogą pozwolić na lepsze zrozumienie dyspozycji rosuwastatyny u poszczególnych pacjentów.

Czy SLE to przyszłość w monitorowaniu farmakokinetyki rosuwastatyny?

Zwalidowana metoda SLE stanowi ważną modernizację w stosunku do ustalonej metody LLE, ponieważ oferuje kilka kluczowych korzyści, takich jak lepszy potencjał automatyzacji, niższa granica oznaczalności, lepsza wydajność ekstrakcji, zmniejszone efekty matrycowe, zwiększona powtarzalność i, co najważniejsze, czystsze ekstrakty, co znacznie poprawia odporność metody i zmniejsza zanieczyszczenie instrumentu oraz przestoje. Te zalety mogą uzasadniać wyższe początkowe koszty związane z SLE w dłuższej perspektywie.

Badanie potwierdza, że SLE jest solidną alternatywą dla LLE do ilościowego oznaczania rosuwastatyny w osoczu. SLE wykazuje lepszą wydajność ekstrakcji, powtarzalność i potencjał automatyzacji. Walidacja metody potwierdza jej niezawodność i czułość, czyniąc ją obiecującym wyborem dla zastosowań o wysokiej przepustowości. Badanie porównawcze z próbkami pacjentów sugeruje, że LLE konsekwentnie niedoszacowuje stężenia w porównaniu do SLE, co dostarcza cennych informacji dla badaczy i klinicystów.

Podsumowanie

Badanie porównawcze metod ekstrakcji SLE i LLE w diagnostyce farmakokinetycznej rosuwastatyny u pacjentów po zawale serca wykazało znaczącą przewagę metody SLE. Nowa technika charakteryzuje się wyższą wydajnością ekstrakcji (96% dla niskiego i 83% dla wysokiego stężenia), lepszą precyzją oraz niższą granicą oznaczalności (0,1 ng/ml wobec 0,3 ng/ml dla LLE). SLE systematycznie wykazuje wyższe stężenia rosuwastatyny w porównaniu do LLE, z medianą 9,1 ng/ml versus 7,4 ng/ml. Metoda SLE, mimo wyższych kosztów początkowych, oferuje lepszy potencjał automatyzacji, zmniejszone efekty matrycowe oraz czystsze ekstrakty, co przekłada się na dłuższą żywotność sprzętu laboratoryjnego. Wyniki badania potwierdzają, że SLE stanowi skuteczną i niezawodną alternatywę dla tradycyjnej metody LLE w ilościowym oznaczaniu rosuwastatyny w osoczu.